محیط کشت زاروک برای اولین بار در سال 1966 میلادی توست کلاود زاروک فرموله شد.
داستان محیط کشت زاروک با آنالیز آب دریاچه چاد و شناسایی عناصر موجود در آن آغاز شد.
دکتر زاروک با بررسی دقیق عواملی همچون عناصر مغذی، دما، نور و pH، موفق شد شرایط طلایی برای رشد اسپیرولینا ماکسیما را پیدا کند.
در این مطلب، ابتدا فرمول کلاسیک زاروک (۱۹۶۶) و شیوه ساخت آن را آموزش میدهیم.
سپس به سراغ ۳ فرمول بهبودیافته (Modified) میرویم که همگی از منابع معتبر علمی گرفته شدهاند.
تفاوت کلیدی این فرمولهای جدید، تغییر در دوز مصرفی کربنات سدیم، عناصر میکرو (ریز مغذیها) و ویتامینها است که باعث بهینهسازی کشت میشود.
محیط کشت زاروک 1966
برای ساخت محیط کشت زاروک ابتدا عناصر را به ترتیب در 850 میلی لیتر حل کنید و در انتها حجم محلول را به یک لیتر برسانید .
| ترکیب | فرمول شیمیایی | مقدار نهایی (g·L⁻¹) | غلظت مولار نهایی |
| بیکربنات سدیم | NaHCO₃ | ۱۶٫۸ | ۲٫۰۰×۱۰-۱ |
| دیپتاسیم هیدروژن فسفات | K₂HPO₄ | ۰٫۵ | ۲٫۸۷×۱۰–۳ |
| نیترات سدیم | NaNO₃ | ۲٫۵ | ۲٫۹۴×۱۰–۲ |
| سولفات پتاسیم | K₂SO₄ | ۱ | ۵٫۷۴×۱۰–۳ |
| کلرید سدیم | NaCl | ۱ | ۱٫۷۱×۱۰–۲ |
| سولفات منیزیم (هپتاهیدرات) | MgSO₄·7H₂O | ۰٫۲ | ۸٫۱۱×۱۰–۴ |
| کلرید کلسیم (بیآب) | CaCl₂ | ۰٫۰۴ | ۳٫۶۰×۱۰–۴ |
| سولفات آهن (II) (هپتاهیدرات) | FeSO₄·7H₂O | ۰٫۰۱ | ۳٫۵۹×۱۰–۵ |
| EDTA (بهصورت دیسدیم) | Na₂EDTA (Na₂C₁₀H₁₄N₂O₈) | ۰٫۰۸ | ۲٫۳۸×۱۰⁻۴ |
| محلول A5 | ترکیب محلول | ۱ ml* | – |
| محلول B6 | ترکیب محلول | ۱ ml* | – |
پس از آمادهسازی محلولهای A5 و B6، به ازای هر لیتر محیط کشت نهایی زاروک، ۱ میلیلیتر از هر کدام اضافه کنید.
محلول A5
برای ساخت محلول A5 موارد ذکر شده در جدول زیر را در 850 میلی لیتر حل کرد و سپس به حجم 1 لیتر میرسانید .
| نام فارسی | فرمول شیمیایی | مقدار (g/L) |
| اسید بوریک | H₃BO₃ | ۲٫۸۶ |
| منگنز (II) کلرید چهارآبه | MnCl₂·4H₂O | ۱٫۸۱ |
| روی سولفات هفتآبه | ZnSO₄·7H₂O | ۰٫۲۲۲ |
| مس (II) سولفات پنجآبه (کات کبود) | CuSO₄·5H₂O | ۰٫۰۷۹ |
| مولیبدن تریاکسید | MoO₃ | ۰٫۰۱۵ |
محلول B6
برای ساخت محلول B6 موارد ذکر شده در جدول زیر را در 850 میلی لیتر حل کرد و سپس به حجم 1 لیتر میرسانید .
| نام فارسی | فرمول شیمیایی | مقدار (g/L) |
| آمونیوم وانادات | NH₄VO₃ | ۰٫۰۲۲۹۶ |
| پتاسیم کروم (III) سولفات (زاج کروم) | K₂Cr₂(SO₄)₄·24H₂O | ۰٫۰۹۶۰ |
| نیکل (II) سولفات هفتآبه | NiSO₄·7H₂O | ۰٫۰۴۷۸۵ |
| سدیم تنگستات دوآبه | Na₂WO₄·2H₂O | ۰٫۰۱۷۹۴ |
| تالیم (III) سولفات | Tl₂(SO₄)₃ | ۰٫۰۴۰۰ |
| کبالت (II) نیترات ششآبه | Co(NO₃)₂·6H₂O | ۰٫۰۴۳۹۸ |
یکی از مهمترین عناصر در این دسته کبالت می باشد که برای ساخت آنالوگ های ویتامین B12 مورد نیاز جلبک ضروری می باشد.
محیط کشت اسپیرولینا انستیتو فرانهوفر(CCCryo)
دستور کلی: برای تهیه ۱۰۰۰ میلیلیتر (یک لیتر) محیط کشت نهایی، نمکهای زیر را در حجم مشخص شده از آب یونزدایی شده (یا مقطر) حل کنید:
جدول ۱: نمکهای اصلی (ماکرونوترینتها) و آهن
این جدول شامل دو محلول ذخیره (Stock) جداگانه (SL I و SL II) است که باید جداگانه تهیه شوند.
| محلول ذخیره (Stock) | حجم | نام فارسی ترکیب | ترکیب (Component) | مقدار در استوک | غلظت در محیط نهایی (Molar) |
| SL I | ۵۰۰ میلیلیتر | بی کربنات سدیم | NaHCO₃ | ۱۳٫۶۱ گرم | ۱٫۶۲×۱۰−۱ |
| کربنات سدیم | Na₂CO₃ | ۴٫۰۳ گرم | ۳٫۸۰×۱۰−۲ | ||
| دی پتاسیم فسفات | K₂HPO₄ | ۰٫۵۰ گرم | ۲٫۸۷×۱۰−۳ | ||
| توضیحات SL I: pH حدود ۹.۰ تا ۹.۲ میشود | |||||
| SL II | ۵۰۰ میلیلیتر | نیترات سدیم | NaNO₃ | ۲٫۵۰ گرم | ۲٫۹۴×۱۰−۲ |
| سولفات پتاسیم | K₂SO₄ | ۱٫۰۰ گرم | ۵٫۷۴×۱۰−۳ | ||
| کلرید سدیم (نمک طعام) | NaCl | ۱٫۰۰ گرم | ۱٫۷۱×۱۰−۲ | ||
| سولفات منیزیم ۷ آبه | MgSO₄ ⋅ 7H₂O | ۰٫۲۰ گرم | ۸٫۱۱×۱۰−۴ | ||
| کلرید کلسیم ۲ آبه | CaCl₂ ⋅ 2H₂O | ۰٫۰۴ گرم | ۲٫۷۲×۱۰−۴ | ||
| سولفات آهن ۷ آبه | FeSO₄ ⋅ 7H₂O | ۰٫۰۱ گرم | ۳٫۶۰×۱۰−۵ | ||
| دی سدیم ادتا | Na₂EDTA | ۰٫۰۸ گرم | ۲٫۱۵×۱۰−۴ | ||
| محلول ریزمغذیها | (SL III & IV) | ۵٫۰ میلیلیتر | – | ||
| توضیحات SL II : pH حدود ۳.۸ تا ۴.۰ میشود | |||||
دستورالعمل آمادهسازی
۱. برای محیط کشت مایع (Liquid Medium):
- محلولهای SL I و SL II را به صورت جداگانه اتوکلاو کنید.
- پس از خنک شدن، دو محلول را با هم ترکیب کنید.
- در صورت نیاز، ویتامین B12 را به میزان ۵×۱۰-۶گرم در لیتر (به صورت محلول استریل) اضافه کنید. (معمولاً ویتامینها فقط برای کشتهای طولانیمدت یا نگهداری استوک نیاز هستند) .
- محلولهای ذخیره (Stock solutions) باید در دمای ۴ درجه سانتیگراد نگهداری شوند.
- pH نهایی پس از ترکیب محلولهای اتوکلاو شده SL I و SL II برابر با ۹.۳ خواهد بود.
۲. برای محیط کشت جامد/آگار (Agarised Medium):
برای تهیه پلتهای آگار یا اسلنتها:
- تهیه استوک ۲ برابر (Double Strength): محلولهای پایه SL I و SL II را با غلظت دو برابر تهیه کنید (یعنی همان مقادیر جدول بالا را در ۲۵۰ میلیلیتر آب حل کنید نه ۵۰۰ میلیلیتر). هر محلول را جداگانه اتوکلاو کنید.
- تهیه محلول آگار: محلول آگار را نیز با غلظت دو برابر تهیه کنید (برای ۱ لیتر محیط نهایی).
- ۵۰۰ میلیلیتر آب مقطر + ۱۰ تا ۱۵ گرم آگار (۱۰ گرم برای لولههای آزمایش، ۱۵ گرم برای پلیتها).
- در مایکروویو حرارت دهید تا حل شود و سپس اتوکلاو کنید.
- اجازه دهید تا دمای ۵۰ الی ۶۰ درجه سانتیگراد خنک شود.
- ترکیب نهایی:
- ۲۵۰ میلیلیتر از محلول I (اتوکلاو شده) + ۲۵۰ میلیلیتر از محلول II (اتوکلاو شده) را با ۵۰۰ میلیلیتر محلول آگار ترکیب کنید.
- مخلوط کنید و ویتامین B12 را به صورت آسپتیک (استریل) اضافه کنید.
- pH نهایی ۹.۳ خواهد بود.
جدول ۲: محلول ریزمغذیها (Micronutrient Solution)
دستور تهیه: برای تهیه ۱۰۰۰ میلیلیتر محلول نهایی ریزمغذی، محلولهای ذخیره زیر را در ۱۰۰ میلیلیتر آب مقطر حل کنید و سپس مقادیر ذکر شده را به حجم نهایی آب مقطر اضافه کنید.
نکته مهم: SL III و SL IV را جداگانه اتوکلاو کنید تا از رسوب نمکها جلوگیری شود، سپس پس از خنک شدن آنها را ترکیب کنید.
| محلول ذخیره | حجم مورد نیاز | نام فارسی ترکیب | ترکیب | غلظت در استوک (گرم/۱۰۰ میل) | غلظت در محیط نهایی (Molar) |
| SL III(حجم کل = ۹۰۰ میل) | ۱ میلیلیتر | سولفات روی ۷ آبه | ZnSO₄ ⋅ 7H₂O | ۰٫۱ گرم | ۱٫۷۴×۱۰−۸ |
| ۲ میلیلیتر | سولفات منگنز ۴ آبه | MnSO₄ ⋅ 4H₂O | ۰٫۱ گرم | ۴٫۴۸×۱۰−۸ | |
| ۵ میلیلیتر | اسید بوریک | H₃BO₃ | ۰٫۲ گرم | ۸٫۰۹×۱۰−۷ | |
| ۵ میلیلیتر | نیترات کبالت ۶ آبه | Co(NO₃)₂ ⋅ 6H₂O | ۰٫۰۲ گرم | ۱٫۷۲×۱۰−۸ | |
| ۵ میلیلیتر | مولیبدات سدیم ۲ آبه | Na₂MoO₄ ⋅ 2H₂O | ۰٫۰۲ گرم | ۲٫۰۷×۱۰−۸ | |
| ۱ میلیلیتر | سولفات مس ۵ آبه | CuSO₄ ⋅ 5H₂O | ۰٫۰۰۰۵ گرم | ۱٫۰۰×۱۰−۱۰ | |
| ۰٫۴ گرم | ا.د.ت.آ (تیتریپلکس ۳) | Na₂EDTA | – | ۱٫۰۷×۱۰−۵ | |
| ۸۸۱ میلیلیتر | آب مقطر | Distilled Water | – | – | |
| SL IV(حجم کل = ۱۰۰ میل) | ۰٫۷ گرم | سولفات آهن ۷ آبه | FeSO₄ ⋅ 7H₂O | – | ۱٫۲۶×۱۰−۵ |
| ۰٫۴ گرم | دی سدیم ادتا | Na₂EDTA | – | ۱٫۰۷×۱۰−۵ | |
| ۱۰۰ میلیلیتر | آب مقطر | Distilled Water | – | – |
دستورالعمل تهیه محیط کشت اسپیرولینا (CCAP)
مراحل آمادهسازی محلولها:
۱. برای ساخت هر بخش، ابتدا ۹۰۰ میلیلیتر آب دیونیزه را داخل ظرف بریزید.
۲. مواد شیمیایی مربوط به هر بخش را به نوبت اضافه کرده و به طور کامل حل کنید.
۳. در نهایت، حجم هر کدام از محلولها را با افزودن آب دیونیزه به ۱ لیتر برسانید.
| بخش | ترکیب شیمیایی | نام فارسی ترکیب | مقدار در لیتر (g/L) |
| محلول شماره ۱ | NaHCO3 | سدیم بی کربنات | ۲۷٫۲۲ گرم |
| Na2CO3 | سدیم کربنات | ۸٫۰۶ گرم | |
| K2HPO4 | دیپتاسیم هیدروژن فسفات | ۱٫۰۰ گرم | |
| محلول شماره ۲ | NaNO3 | سدیم نیترات | ۵٫۰۰ گرم |
| K2SO4 | پتاسیم سولفات | ۲٫۰۰ گرم | |
| NaCl | سدیم کلرید | ۲٫۰۰ گرم | |
| MgSO4.7H2O | منیزیم سولفات ۷ آبه | ۰٫۴۰ گرم | |
| CaCl2 | کلسیم کلرید | ۰٫۰۲ گرم | |
| FeSO4 | آهن (II) سولفات | ۰٫۰۲ گرم | |
| Na2EDTA | دی سدیم ادتا | ۰٫۱۶ گرم | |
| Micronutrient Sol (1) | محلول ریزمغذیها (۱) | ۱۰٫۰ میلیلیتر | |
| Vitamin Sol (2) | محلول ویتامینها (۲) | ۵٫۰۰ میلیلیتر |
نکات کلیدی :
حجم مبنا: مقادیر وزنی ذکرشده در جدول مواد شیمیایی، برای تهیه ۲ لیتر محیط کشت نهایی است.
جلوگیری از رسوبگذاری: به منظور پیشگیری از تهنشینی مواد در فرآیند اتوکلاو، این محیط کشت در دو بخش مجزا (محلول ۱ و محلول ۲) آماده میشود.
استریلسازی و ترکیب نهایی:
- محلولهای ۱ و ۲ را به صورت جداگانه اتوکلاو کنید و اجازه دهید تا کاملاً خنک شوند.
- پس از همدما شدن با محیط، دو محلول را به نسبت یک به یک (۱:۱) با یکدیگر مخلوط نمایید.
⚠️ توصیه اختصاصی ایران آلجی
در منبع اصلی (CCAP) به لزوم فیلتراسیون ویتامینها اشارهای نشده است؛ اما سایت ایران آلجی قاطعانه توصیه میکند که محلول ویتامینها را پس از سرد شدن محلول شماره ۲، از طریق فیلتر سرسرنگی به محیط کشت اضافه کنید.
به یاد داشته باشید که دمای بالای اتوکلاو میتواند ساختار برخی از ویتامینهای حساس به حرارت را تخریب کند و کارایی محیط کشت را کاهش دهد.
دستورالعمل ساخت محلولهای استوکِ ریزمغذیها (Trace Elements) و ویتامینها در ذیل آمده است .
شما باید این دو مورد را به صورت دو محلول جداگانه تهیه کرده و سپس به میزان تعیینشده در جدول بالا ، به محلول شماره ۲ اضافه نمایید.
میتوانید محلول های ریز مغذی و ویتامین را به صورت فریز شده در دمای ۲۰- درجه نگهداری کنید (متن اصلی منبع).
محلول ریزمغذی ها
برای ساخت محلول ریز مغذی ها ابتدا درون ظرف ۹۰۰ میلی لیتر آب دیونیزه اضافه می کنیم سپس مواد را به ترتیب به محلول اضافه کرده و حل می کنیم ؛ سپس محلول را به حجم یک لیتر می رسانیم .
| ترکیب شیمیایی | نام فارسی | مقدار در لیتر |
| ZnSO4.7H2O | روی سولفات ۷ آبه | ۰٫۰۰۱ گرم |
| MnSO4.7H2O | منگنز سولفات ۷ آبه | ۰٫۰۰۲ گرم |
| H3BO3 | بوریک اسید | ۰٫۰۱۰ گرم |
| Na2MoO4.2H2O | سدیم مولیبدات ۲ آبه | ۰٫۰۰۱ گرم |
| Co(NO3)2.6H2O | کبالت نیترات ۶ آبه | ۰٫۰۰۱ گرم |
| CuSO4.5H2O | مس سولفات ۵ آبه | ۰٫۰۰۰۰۵ گرم |
| FeSO4.7H2O | آهن سولفات ۷ آبه | ۰٫۷۰ گرم |
| Na2EDTA | دی سدیم ادتا | ۰٫۸۰ گرم |
محلول ویتامینها
برای ساخت محلول ویتامین ها مانند ریزمغذی ها عمل می کنیم . ابتدا درون ظرف ۹۰۰ میلی لیتر آب دیونیزه اضافه می کنیم سپس مواد را به ترتیب به محلول اضافه کرده و حل می کنیم ؛ سپس محلول را به حجم یک لیتر می رسانیم .
| نام ماده | نام فارسی | مقدار در لیتر |
| Biotin | بیوتین | ۰٫۰۰۰۲ گرم |
| Calcium pantothenate | کلسیم پانتوتنات | ۰٫۰۲ گرم |
| Cyanocobalamin | سیانوکوبالامین (B12) | ۰٫۰۰۴ گرم |
| Folic acid | اسید فولیک | ۰٫۰۰۰۴ گرم |
| Inositol | اینوزیتول | ۱٫۰۰ گرم |
| Nicotinic acid | نیکوتینیک اسید | ۰٫۰۲ گرم |
| Thiamine HCl | تیامین هیدروکلراید | ۰٫۱۰ گرم |
| Thymine | تیمین | ۰٫۶۰ گرم |
با کلیک بر روی آیکون های زیر ما را در شبکه های اجتماعی دنبال کنید .
